過表達靶蛋白的穩(wěn)轉細胞株構建

        外源基因在細胞中的表達可分為兩大類，一類是瞬時表達，外源DNA/RNA不整合到宿主染色體中，雖然可以達到高水平的表達，但通常只持續(xù)幾天；一類是穩(wěn)定表達（構建穩(wěn)轉株），外源DNA整合到宿主細胞染色體上，使宿主細胞可長期表達目的基因。

        建立穩(wěn)定細胞株，基本原理是將外源DNA克隆到具有某種抗性的載體上，載體被轉染到宿主細胞并整合到宿主染色體中，用載體中所含的抗性標志進行篩選，得到可穩(wěn)定表達目的蛋白的細胞株。

      示例：MSLN過表達細胞株的構建

1.       過表達人MSLN蛋白(Q13421)的慢病毒載體構建，其結構圖如圖 1所示：

Fig.1  MSLN慢病毒載體圖譜

2.       將制備的慢病毒載體及慢病毒包裝質粒PspaX2、PMD2 .0G轉染293T細胞，包裝72小時后回收病毒；

3.       檢測病毒滴度，以三種不同的滴度感染CHO-K1宿主細胞，24小時后更換培養(yǎng)基；

4.       以未感染慢病毒的CHO-K1細胞（以下稱為CHO-K1-blank）為陰性對照組，以感染慢病毒的CHO-K1細胞（以下稱為CHO-K1-MSLN）cell pool為實驗組，各組加入不同的藥物濃度加壓篩選，選取適當?shù)乃幬餄舛群髷U大培養(yǎng)4-5代。

5.       以梯度稀釋法在96孔板中培養(yǎng)CHO-K1-MSLN細胞，5天后觀察細胞生長并挑選單克隆細胞進行擴大培養(yǎng)。

6.       取2E5擴大培養(yǎng)的單克隆細胞，F(xiàn)ACS buffer洗兩遍后加入陽性檢測抗體(220812A01)^[1]，如下圖所示，流式細胞術檢測MSLN蛋白的表達。

流式檢測MSLN表達 

        費洛斯的慢病毒感染篩選穩(wěn)定細胞株平臺基于載體中所含的抗性標志進行篩選，常用的真核表達載體的抗性篩選標志物有新霉素（neomycin）、潮霉素（hygromycin）和嘌呤霉素(puromycin)，篩選得到可穩(wěn)定表達目的蛋白的穩(wěn)定細胞株，為基礎研究（基因功能研究）、藥物篩選（CAR開發(fā)前期scFv篩選）等提供科研助力。

[1]. Yuchun Gu, Le Yin. A kind of CAR-NK cell preparation method of target mesothelin[P].China.

[2].CN109762844A.2019.05.17